气质联用仪/液质联用仪是怎么做到定量的
发布时间:2021-09-04

气质联用仪/液质联用仪的定量方法研究



质谱信号的强度=粒子总数 x 离子化效率(就是你说的离子化难易程度)


引言


采用一系列方法测定或者至少能够固定(以LCMSMS为例,就是优化电压,喷雾角度,流动相组成比例,三气的流量,基质的组成全部固定下来)特定方式下的离子化效率,质谱是可以用于定量的。


举个例子,调谐好系统之后,你喷入1ppb的利血平溶液,得到的信号为一万;再喷入10ppb的利血平得到的信号为十万。然后你喷入未知浓度的利血平,发现其信号值为五万,你就可以认为未知浓度的利血平为5ppb。


质谱的定量和紫外检测器,蒸发光检测器没什么本质区别,只不过质谱的线性范围比较令人抓狂而已。当然还有一系列的问题,比如说特别是很多生物分析的样品,你稀释十倍之后很可能质谱信号的强度不会下降十倍。1ppm对应的离子计数为一万,0.1ppm对应的离子计数不是一千而很可能是五千三千。


任何物理量的定量过程都无非是和“尺子”去对比,质谱分析当然也不例外。要实现质谱定量分析一般有两种方法。



1外标法



将待测物质A的标准品(特点是纯度非常高,有时也可称之为该物质的纯品)用某种有机溶剂S稀释成不同的浓度的标准溶液,分别取等量(一般是等体积)的这些不同浓度的标准溶液进行质谱分析。由此可以得到一组样品量和信号值一一对应的数据,以其绘制成的曲线称为标准曲线。现在就有了一把还不错的尺子,然后就可以去拿要检测的实际样品R进行质谱分析了。根据标准曲线就可以由得到的信号值去反推物质A在该实际样品R中的含量了。



2内标法



将已知量待测物质A的同位素标记物I掺杂到实际样品中去,然后进行质谱分析。同位素标记物一般是利用H原子的同位素氘,即A里面的H在其同位素里都换成了氘,这样通过A的化学式就能推算出,A和I的质谱峰的差别也就知道了。根据两者信号的比值和I的实际掺杂量就能推算出A的质量。为什么选择同位素标记物进行标定呢?原因就是因为两者之间的各种物理和化学属性非常接近,除了分子量的差别几乎可以认为一模一样,因此就可以排除由于样品中基质的干扰(离子抑制之类的)引起的误差。值得一提的是这种情况在外标法里是无法避免的。


当然实际上为了简化流程或者实在是不好找同位素标记物(实际上有大量的同位素标记物可以买到),或者节省成本以及其他原因,往往采用其他不是同位素的物质做标记物,当然标准还是要往物性相似上去贴的。这样做出的定量结果,在一定程度上也是可以接受的。


按理说保持完整性还得分析个优缺点,不过今天不想分析了,不能为了科普不干正事了。真是这一行的各位,直接去找本教材看看吧,都是常识。



质谱信号强度与待分析物含量的关系


任何定量分析方法都需要建立实验测量信号与待分析物的量的关系。很幸运的是,在质谱中,通常也可以建立这样的关系,因此质谱信号是可以用于定量的。从题主的说明来看,Ta的疑惑主要在这里。


既然问题是“质谱是怎样做到定量的?”,我们不妨把质谱信号的产生按时间顺序粗略分为三个步骤,即离子的产生,传输与检测。


产生离子时,不同样品分子的电离通常是相互独立的。因此样品量越多,其产生的离子也就越多。目前常用的各种离子化方法(EI、ICP、ESI、MALDI等)在实验中(严格来说仅在一定浓度范围内——术语是动态范围,dynamic range)都至少满足样品量与产生离子量的正相关,一般情况下也可以进一步近似成线性相关。


传输离子时,简单来说可以认为传输效率与被传输离子的量无关;(严格地说,被传输的离子太多时,相同电荷的互相排斥会造成离子束的“体积”变大,导致传输效率下降。这种影响在空间有限的离子阱中表现得更加明显,因此在离子阱质谱中一个重要的技术就是适当控制进入仪器的离子数量,使其既不太少也不太多。)


检测离子时,不论是使用光电倍增管的检测器,还是检测镜像电流的检测器(ICR/Oribtrap),其信号强度(在一定范围内)均与离子数量大致线性相关。


废话几句,可能会使题主感觉质谱不能定量的原因之一是,我们看到的质谱图常用相对强度作为纵坐标,即0-100%最强峰,而不展示信号的绝对强度。但在做质谱的时候,仪器记录的当然是绝对强度(相对强度也是通过绝对强度换算出来的)。我们需要用绝对强度来定量时,就需要这部分平时不常看的信息了。


另外,在谈到色谱-质谱联用方法时,待分析物与实验测量信号的关系之中又多了一层色谱,即待分析物含量->色谱流出物中样品含量->质谱信号。与EI谱图分析以相对强度为主不同,在色谱-质谱联用时,信号的绝对强度就成了我们天天都要关心的内容,因为质谱信号强度随时间的变化就是实验的色谱图,通常以总离子强度或者某一特定质荷比离子的强度作图。


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1定量的两种方法



说过了为什么质谱可以定量,下面我们来看看具体的定量方法。常用的定量方法有两种,外标法与内标法。


外标法


用已知量的标准样品A和未知量的待测样品A分别进行实验;我们会得到以下三个信息:标准样品的量(已知);标准样品的信号强度;待测样品的信号强度。(假设样品的响应=常数*浓度,从这三个信息即可算出待测样品的量。)


为了更加精确地测定未知量的样品,我们希望标准样品的信号强度与待测样品的信号强度尽量接近(以减少非线性响应的影响)。因此常用的外标法会测量一系列已知量的标准样品,绘制一条工作曲线,再用拟合的方法确定未知样的量。


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内标法


外标法主要有以下两方面的局限:1标样和待测样是独立进行实验的,实验间的偶然误差无法消除;2标样和待测样的基质(即除待分析物外的其它成分)不同,基质有可能会带来不同的影响,也会产生误差。


那么,如果我们把已知量的标准样品B直接加入待测样品A,就可以把标准样品和未知样品的测定在同一次实验和同样基质中完成,也就消除了两次实验和基质不同造成的误差,这就是内标法。


(如果加入的标准样品和待测样品是同种物质A,那么由于它们不可区分,只通过一次实验是不能定量待测样的,这时我们在加入标样前后分别进行两次测量,即测量待测样及待测样+标样的信号,即可计算出待测样的量。)



2质谱相关的特殊定量细节



同位素稀释


前面内标法的介绍中我们可以发现,最理想的内标物既要和待测样相同(具有相同的响应系数)又要不同(仪器可以区分二者的信号),这对矛盾的集合体就是同位素内标。


由于不同同位素的化合物具有近似相同的物理化学性质,离子化时的响应通常也是相同的,而它们具有不同的质荷比m/z,即可在质谱中被区分出来。因此同位素标准品是最理想的内标物。


另外,由于某些元素的天然同位素分布有一定的比例,当我们加入一定量的同位素内标时,可以把对信号绝对强度的测量转化为对信号相对比例的测量,从而提高实验的准确性。

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选择反应监测


在不太复杂的体系中,我们只要按照分子量就可以定性某种化合物了。但对于复杂混合物(如石油产品/生物样品)而言,很多化合物具有相同或相近的质量(同分异构体质量完全相同,有些化合物分子量非常接近,如CO和N2,要考虑仪器的质量分辨率是否能区分二者),此时仅靠测量质量就不能确定这个化合物是否就是我们关心的“the one”了。


在串联质谱 (Tandem MS) 仪器中,我们不仅可以把质谱仪理解为一个称量离子的“天平”,它还具有了离子“镊子”(选择某个特定的离子把它分离出来)和“剪刀”(把某个/某些离子激活并打成碎片)的功能。



通过母离子和子离子的两步选择,我们可以在复杂体系中精确定位到我们关心的化合物,同时,两次离子选择还可减少复杂基质的干扰,降低背景噪声(获得更低的检出限)并提高方法的动态范围。因此选择反应监测是目前色谱(气相色谱/液相色谱)-质谱联用中最常用的定量方法。
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